Veneno de Bothrops insularis adaptação aos itens alimentares

Resumo

Mudanças ontogenéticas na dieta e na composição do veneno são características freqüentemente observadas em espécies do gênero Bothrops. A serpente Bothrops insularis é endêmica da Ilha da Queimada Grande, litoral Sul de São Paulo, cuja separação do continente ocorreu há aproximadamente 11 000 anos, após a última glaciação ao final do Pleistoceno. Não existem mamíferos na ilha e esta espécie alimenta-se, na fase juvenil, de animais ectotérmicos (artrópodes e anfíbios) e de endotérmicos (aves migratórias) na fase adulta. A população apresenta anormalidades sexuais evidenciadas por machos, fêmeas e intersexos (fêmeas que apresentam hemipênis rudimentares, porém não funcionais). Três filhotes de B. insularis (1 macho e 2 intersexos) nascidos em cativeiro, de uma fêmea intersexo, foram mantidos no Laboratório de Herpetologia do Instituto Butantan, seus venenos extraídos (idades de 10, 15, 20, 24,33 e 41 meses) e liofilizados para utilização em ensaios subseqüentes. Utilizou-se também o veneno da mãe da ninhada e um pool de venenos de exemplares adultos. A análise eletroforética (SDS-PAGE 7,5- 17,5%) evidenciou similaridades entre as amostras de venenos nas diferentes fases de vida dos animais. A análise densitométrica revelou um aumento pronunciado da expressão de uma banda protéica na faixa de massa molecular de 24kDa. O teor protéico dos venenos variou de 618 a 1189 g de proteína por mg de veneno. Os resultados experimentais sugerem que fosfolipases A2 e hialuronidases não têm expressão pronunciada na fase adulta dos animais (41 meses). Os venenos foram capazes de hidrolisar as cadeias A e B do fibrinogênio e promover áreas de lise em placa de fibrina, independentemente da idade analisada. O progressivo aumento de intensidade da atividade hemorrágica e proteólise em zimografia sugere uma regulação da expressão de proteases, sobretudo de metaloproteases (uma característica importante, uma vez que esta espécie apresenta uma alteração ontogenética de dieta, alimentando-se de presas maiores quando os animais se tornam adultos). Por outro lado, a atividade proteolítica sobre a caseína não apresentou um aumento ontogenético significativo. Ensaios com inibidores de proteases, mostraram que EDTA e ortofenantrolina (10 mM) diminuíram expressivamente a atividade gelatinolítica em zimografia, reduziram a área de lise em placa de fibrina e inibiram a clivagem das cadeias A e Bdo fibrinogênio. Os venenos dos animais jovens (15 meses) mostraram-se mais ativos nos ensaios de coagulação sanguínea (Dose Mínima Coagulante sobre o Plasma e ativação dos fatores X e II da cascata de coagulação sanguínea) em relação ao dos adultos (41 meses). Observou-se uma maior toxicidade dos venenos para abelhas e aves, contudo não foi possível estabelecer diretamente uma relação ontogenética. Para mamíferos (camundongos) os venenos do Intersexo 1 e do Macho (41 meses) apresentaram menores valores de DL50 em relação aos demais. A miotoxicidade das amostras dos venenos mostrou-se acentuada na fase inicial de vida dos animais (15 meses). Foram evidenciadas variações individuais ao longo das análises efetuadas neste trabalho, contudo a variabilidade ontogenética mostrou-se presente na maioria dos ensaios realizados. A seletividade do veneno para presas locais foi demonstrada pela eficácia do veneno para artrópodes e aves, em detrimento a mamíferos. Desta forma, conclui-se que o veneno possui peculiaridades na sua composição que favorecem a alimentação desta serpente em seu habitat insular e, embora haja uma marcante alteração de dieta durante a ontogênese desta espécie, a toxicidade do veneno para os itens alimentares locais é uma característica presente durante toda a vida dos animais.

Abstract

Ontogenetic changes on diet and venom composition are a common feature among Bothrops species. Bothrops insularis is an endemic snake of Queimada Grande Island, South coast of são Paulo State, which mainland separation has ocurred for about 11 000 years ago, after the last glaciation, at late Pleistocene. There are no mammals on the Island and B .insularis feed on ectothermic preys when young (arthropods and amphibians) and endothermic (migratory birds) when becomes adult. Sexual abnormalities are often verified on B. insularis population with males, females and intersexes existence (females with non-functional rudimentary hemypenis). Three B. insularis siblings (1 male and 2 intersexes) borned on captivity, from an Intersex female, were kept in Herpetology Laboratory on Instituto Butantan. Venoms were extracted (10, 15, 20, 24, 33 and 41 months of animal’s age) and lyophilized for subsequent assays. Offspring’s mother venom and a pool of B. insularis adult venoms were also analyzed as a comparison parameter. Electrophoretic profiles (SDS-PAGE 7,5- 17,5%) showed similar patterns among samples at distinct animal’s ages. Densitometric analysis showed increase of expression of proteic band at 24 kDa of molecular mass range. Protein content varies of 618 up to 1189 g of protein per mg of venom. Experimental results suggests that phosfolipases A2 and hyaluronidases do not have an increase on its expression on adult phase (41 months) of B .insularis. Venoms were able to hydrolyze A and B fibrinogen chains and to promote lysis on fibrin plate, regardless of animal’s age. The increase of haemorrhagic activity and proteolysis on zimography profiles, suggests a regulation of protease expression, mainly of metaloproteases (an important characteristic, since this species has an ontogenetic shift on its diet, feeding on larger preys when becomes adult). On the other hand, proteolytic activity upon casein did not show significative ontogenetic variability. Protease inhibithors assays showed that EDTA and orthophenantrolin (10 mM) expressively reduced gelatinolytic activity on zimography, fibrin plate lysis area, and were able to prevent A and B fibrinogen chains cleavage. Venoms from young animals (15 months) had higher coagulant activity than adult ones (Minimum Coagulant Dose upon human Plasma and activation of blood coagulation cascade factors X and II). Venom toxicity was higher for bees (just-emerged Apis mellifera) and chicks (one day age Bovans white chicks), although a direct relation with ontogeny was not established. Intersex 1 and male venoms (41 months) showed the lower LD50 values for mammals (mice). Prominent myotoxicity was found for young venoms (15 months). Experimental results showed individual variability, and, mainly, a conspicuous ontogenetic variability. Venom selectivity towards local preys was demonstrated by the expressive toxicity upon arthropods and chicks, in comparison to mammals. Our results show that Bothrops insularis venom had peculiarities on its composition that support snake’s diet on its insular habitat and, although a clearly ontogenetic diet change occurs on this species, venom toxicity towards local preys is a characteristic present during all lifetime of this species.
12. Nossos resultados sugerem uma especificidade do veneno de B.insularispara presas locais.

5. DISCUSSÃO
5.1 Aspectos gerais do desenvolvimento e da variabilidade ontogenética do veneno de Bothrops insularis
Neste trabalho reportamos a variabilidade ontogenética no veneno daserpente Bothrops insularis, um animal endêmico e criticamente ameaçado deextinção. O status de Criticamente em Perigo (Critically Endangered) ocupado poresta espécie na lista vermelha da IUCN, bem como algumas peculiaridadesbiológicas, como uma ninhada pequena - uma média de 6 filhotes (Hoge etal.1959) - e a infertilidade de algumas fêmeas verdadeiras, são fatores limitantesaté mesmo no manejo em cativeiro desta espécie (Hoge et al. 1959; Marques etal. 2004). Atualmente, não é mais permitido a retirada de animais da Ilha, o queimpossibilitou a obtenção de uma amostragem maior. Apesar destes fatores, osresultados obtidos neste trabalho forneceram importantes subsídios para oentendimento da relação veneno / presa em B. insularis.
Não existem dados na literatura a respeito do desenvolvimento em cativeirodesta espécie. Nós observamos que, tanto na produção de veneno, quanto nocrescimento (comprimento total e massa) os animais apresentaram um padrãosimilar até aproximadamente os 24 meses, quando houve então uma nítidadivergência, com os intersexos apresentando um padrão semelhante entre si, ediferenciado em relação ao macho. O período de 20 a 24 meses de idade éreportado como sendo a fase de maturação sexual em Bothrops (Leloup, 1975),uma possível causa das divergências em relação aos dados biométricosobservados neste trabalho. O dimorfismo sexual verificado durante odesenvolvimento de B. insularis é relativamente comum na maioria das espéciespertencentes ao gênero Bothrops, em que as fêmeas apresentam um porte maior(massa e comprimento total) em relação aos machos (Travaglia-Cardoso, 2000).Wüster et al. (2005), em análise de caracteres morfológicos de B. insularis,também relata uma diferenciação entre machos e fêmeas (fêmeas verdadeiras eintersexos), sobretudo em relação ao tamanho (comprimento rostro-cloacal).Na grande maioria dos experimentos realizados neste trabalho, observamosuma expressiva variabilidade ontogenética nos venenos de B.insularis. Diferentedos venenos dos animais na fase jovem (10-15 meses), os venenos dos adultosnão diferiram significativamente dos venenos utilizados como parâmetros decomparação (o veneno da Mãe da ninhada e do Pool de B.insularis), ou seja,animais adultos. O teor protéico observado foi similar àquele reportado naliteratura para os venenos botrópicos de uma forma geral, da ordem de cerca de90% (Furtado et al.1991). Embora o veneno do Intersexo 1 tenha apresentadomenores valores em relação aos outros animais, o perfil eletroforético (sobcondições redutoras ou não) demonstrou um padrão semelhante aos outrosvenenos. A eletroforese sob condições não redutoras revelou a presença debandas protéicas majoritárias nas faixas de 94, 50, 27 e 14 kDa em todos osvenenos e em todas as idades analisadas. Entretanto, na eletroforese emcondições redutoras foi possível observar diferenças expressivas entre osvenenos e entre as diferentes fases de vida dos animais, uma vez que a reduçãode pontes dissulfeto inter e intra-moleculares exprime com melhor desempenhodiferenças nos perfis protéicos, favorecendo a desagregação de complexosprotéicos e, desta forma, permitindo uma diferenciação mais evidente entre asamostras (Serrano et al.2005). Através desta abordagem, as bandas protéicasmajoritárias encontraram-se dispostas nas faixas de 50, 37, 24 e 14 kDa.Tan et al.(1993) detectaram bandas de alta massa molecular em amostrasde venenos de exemplares jovens de Notechis scutatus, ausentes nos exemplaresadultos. Furtado et al. (1991) também relataram esta característica em venenos dejovens de algumas espécies de Bothrops e Kamiguti (1988) em venenos derecém-nascidos de B. jararaca. Por outro lado, Lopéz-Lozano et al. (2002)evidenciaram a expressão pronunciada de uma banda de cerca de 23 kDa emvenenos de exemplares adultos de B. atrox.Em nossas análises uma característica interessante, evidenciada naeletroforese sob condições redutoras e comum a todas as amostras de venenoanalisadas, foi o aumento ontogenético da expressão de uma banda protéica nafaixa de 24 kDa, característica confirmada também através de análisedensitométrica.
Nos venenos botrópicos, de uma forma geral, essa faixa de massamolecular compreende serinoproteases e, principalmente, metaloproteases daclasse P-I (Serrano e Maroun, 2005; Serrano et al. 2005). Modesto et al. (2005)purificaram e seqüenciaram do veneno de B. insularis uma metaloprotease daclasse P-I de 22,6 kDa, chamada Insularinase A, que, conforme análise do cDNAcorrespondente, é resultante do processamento pós-traducional de umametaloprotease da classe P-II.
A atividade proteolítica sobre a caseína foi mais expressiva para o venenodo Macho e, de uma forma geral, apresentou um decréscimo na idade adulta (41meses). Contudo, observamos um outro perfil de atividade através da técnica dezimografia em gel de poliacrilamida. A presença de íons cálcio (um importante co-fator para a atividade enzimática de muitas proteases) no ensaio de zimografia (ea ausência deste íon no ensaio de atividade proteolítica sobre a caseína) podeestar relacionada com a ligeira diferença de resultados observada nos doisexperimentos. Mediante os perfis obtidos por zimografia, é possível sugerir umaregulação ontogenética da expressão de proteases, sobretudo demetaloproteases, nos venenos analisados. De acordo com a região de massamolecular em que se verificou a atividade proteolítica sobre a gelatina, pode-sesugerir a presença de duas classes de metaloproteases no veneno de B. insularis:metaloproteases da classe P-III (região de 45 kDa nos géis de zimografia) emetaloproteases da classe P-I (região de 27 kDa). Outra característicainteressante foi a presença de metaloproteases nas faixas de aproximadamente90 kDa nos venenos da Mãe da ninhada e do Pool de B. insularis. Possivelmenteestas bandas correspondem a precursores não processados de metaloproteasesou a metaloproteases diméricas da classe P-III (Fox e Serrano 2005; Menezes etal. 2006).
O aumento da atividade hemorrágica apresentada pelos venenos dosanimais adultos pode ser uma conseqüência da maior expressão demetaloproteases durante a ontogênese de B. insularis, uma vez que estasenzimas estão freqüentemente associadas a processos hemorrágicos (Gutiérrez eRucavado, 2000; Gutiérrez et al. 2005; Serrano e Fox, 2005). Nossos dadoscorroboram aqueles reportados por Junqueira-de-Azevedo e Ho (2002) em análiseda diversidade do transcriptoma da glândula de veneno de B. insularis, em que severifica que metaloproteases são os transcritos majoritários (aproximadamente42%) dentre as seqüências correspondentes a toxinas do veneno de B. insularis.Proteases têm um importante papel na composição e atividades dosvenenos de serpentes, estando relacionadas a diversos processos fisiológicos quetêm, como propósito primordial auxiliar na digestão de uma presa “não triturada”pela ação mecânica de dentes (Gans e Elliot, 1968; Thomas e Pough, 1979;Mackessy, 1993, Mackessy, 2003).
Furtado et al. (1991) verificou uma expressiva variação ontogenética daatividade proteolítica nos venenos de algumas espécies de Bothrops (B.alternatus,B. cotiara, B erythromelas, B. jararaca, B. jararacussu, B. moojeni, B. neuwiediparanaensis, B .n. pauloensis e B. n. urutu), com um aumento pronunciado na faseadulta dos animais. Característica semelhante foi observada por Gutiérrez et al.(1990) em análise da variabilidade ontogenética do veneno de Lachesis mutastenophrys.
Mackessy (1993) observou um aumento da atividade proteolítica no venenode exemplares adultos em relação a juvenis da cascavel norte-americana Crotalusviridis oreganus. O aumento da atividade proteolítica nos venenos dos adultosfavoreceria, segundo o autor, o processo de digestão de presas maiores. EmB.insularis, um recrutamento maior de proteases na fase adulta pode estarassociado a um processo de digestão de presas maiores. Esta característica é deextrema importância para a espécie, que apresenta uma mudança ontogenéticade dieta, alimentando-se de presas maiores na fase adulta (Martins et al. 2002).Todavia, os efeitos do envenenamento e, conseqüentemente, a suacomplexidade, é atribuída à sinergia de diversas atividades (Kochva et al.1983;Mackessy, 1993; Mebs, 1999). Neste contexto a atividade hialuronidásica exerceuma função importante no envenenamento por facilitar a dispersão do veneno porentre os tecidos da presa, a partir da hidrólise do ácido hialurônico (ummucopolissacarídeo presente na matriz extracelular, que confere adesão e coesãoentre as células na formação dos tecidos) (Pukrittayakamee et al.1988). Girish etal. (2002), observou a presença de diversas isoformas de hialuronidases emvenenos de algumas serpentes pertencentes às famílias Elapidae e Viperidae,distribuídas em um amplo espectro de massa molecular (77 a 14 kDa) nasdiferentes espécies.
Nossos resultados apontam para uma maior atividade hialuronidásica nosvenenos dos jovens (10 meses de idade). A acentuada atividade hialuronidásicado veneno nas fases iniciais do desenvolvimento pode compensar o menortamanho dos animais (menor produção de veneno) e a menor quantidade deveneno inoculada numa eventual investida contra uma presa. Desta forma,embora apresentem uma baixa atividade proteolítica (se comparado ao veneno nafase adulta) o veneno dos filhotes conta com uma maior atividade de “fatores dedispersão” (hialuronidases) que, atuando juntamente com outros componentes doveneno, auxiliam na subjugação da presa.
Processos hemostáticos são geralmente alvos comuns de toxinas devenenos de viperídeos, sobretudo de venenos botrópicos (Nahas et al.1979;Kamiguti e Cardoso, 1989; Ouyang, et al.1992; Sano-Martins e Santoro, 2003;Swenson e Markland, 2005) e estão intrinsecamente atrelados a atividade deproteases. Os venenos de viperídeos apresentam componentes que atuam sobrediversos fatores da cascata da coagulação sanguínea (Nahas et al. 1979; Kamigutiet al. 1986; Kamiguti et al. 1989; Ouyang et al. 1992; Swenson e Markland, 2005).O quadro de incoagulabilidade sanguínea ou alterações no tempo de coagulação,característico de acidentes botrópicos de uma forma geral, advém da atividade decomponentes (em sua maioria proteases) em etapas cruciais das vias da cascatade coagulação, como na ativação do fator X ou da protrombina, por exemplo,(Kamiguti et al.1989; Ouyang et al.1992; Kini, 2005).
Diversos trabalhos relatam implicações da variabilidade ontogenética na
atividade coagulante dos venenos. Kamiguti (1988) evidenciou diferençassignificativas na atividade coagulante de venenos de exemplares recém-nascidose adultos de B. jararaca. Furtado et al. (1991) também verificaram diferençasacentuadas em relação a ação coagulante dos venenos de filhotes de algumasespécies brasileiras do gênero Bothrops sobre o plasma humano , bem como aacentuada ativação dos fatores X e II da cascata de coagulação sanguínea.Saldarríaga et al. (2003) relataram maior atividade coagulante nos venenos deexemplares jovens (de 6 meses a um ano de vida) de B. asper e B. atrox daColômbia. Resultados semelhantes foram verificados por López-Lozano et al.(2002) em análise da atividade coagulante de venenos de jovens e adultos de B.atrox da Amazônia.
Nahas et al. (1979) já haviam relatado a atividade tipo-trombina e ativadorade fator X no veneno de B. insularis, bem como de outras espécies do mesmogênero. Em nossos resultados os valores obtidos no ensaio de Dose MínimaCoagulante sobre o plasma apontam para uma atividade coagulante mais intensano veneno dos animais jovens (15 meses). O mesmo padrão foi verificado emrelação à capacidade dos venenos de promoverem a ativação do fator X dacascata de coagulação sanguínea. Já em relação à ativação do fator II e atividadetipo-trombina, não verificamos variabilidade ontogenética.
Embora os ensaios referentes à coagulação sanguínea utilizados nesteprojeto caracterizem a intensa ação coagulante dos venenos dos animais jovens,as proteínas-alvo (fatores de coagulação) podem ser múltiplas e melhorelucidadas quando estudadas utilizando toxinas isoladas dos venenos. Contudo, aativação do fator X é um passo importante na cascata de coagulação sanguínea eesta atividade, sendo mais elevada nos venenos dos jovens, possivelmente podeestar associada à intensa atividade coagulante sobre o plasma verificada emnossos resultados. Kamiguti (1988) em análise das atividades coagulante eativadora dos fatores X e II (todas mais exacerbadas nos venenos de exemplaresrecém-nascidos de B. jararaca em relação aos adultos) sugere tanto diferençasquantitativas (conseqüência de uma maior expressão de ativadores de fatores X eII nos venenos dos jovens) quanto qualitativas (como a possibilidade de ocorreremisoformas nos venenos dos jovens, que atuariam com maior eficácia na ativaçãodos fatores X e II da cascata de coagulação sanguínea).
A atividade fibrin(ogen)olítica é uma característica comum aos venenos damaioria das espécies de viperídeos, estando freqüentemente associada aatividade de metalo e serinoproteases (Swenson e Markland, 2005; Serrano eMaroun, 2005). Em nossos resultados verificamos que os venenos clivaram tantoa cadeia Aα quanto a Bβ do fibrinogênio. Esta ação parece estar intimamenteassociada a atividade de metaloproteases, uma vez que observamos a inibiçãodesta atividade quando as amostras foram incubadas previamente com inibidoresdestas enzimas (EDTA e ortofenantrolina). Da mesma forma, a atividadefibrinolítica, avaliada em placa de fibrina, mostrou uma relação com a atividade demetaloproteases, sendo drasticamente afetada quando os venenos foramincubados previamente com ortofenantrolina.
A Insularinase A, uma metaloprotease da classe P-I, purificada por Modestoet al. (2005) do veneno de B. insularis, além de promover a ativação dos fatores Xe II da cascata de coagulação sanguínea, cliva as cadeias Aα e Bβ dofibrinogênio. Por outro lado, Selistre e Giglio (1987) isolaram e caracterizaram umaserino protease de 45 kDa, com atividade tipo-trombina do veneno de B. insularis,que também cliva as cadeias Aα e Bβ do fibrinogênio.
Não foi possível estabelecer uma relação direta entre a idade analisada e aatividade fibrinogenolítica dos venenos, uma vez que o padrão de atividade foisemelhante entre as amostras independente da idade analisada. Entretanto, emrelação a atividade fibrinolítica, foi possível observar um aumento relativo deatividade na fase adulta dos animais (41 meses).
A miotoxicidade verificada no envenenamento botrópico é freqüentementeatribuída a atividade de fosfolipases A2 (PLA2) (Gutiérrez e Lomonte, 1989;Gutiérrez e Lomonte, 1995; Kini, 1997; Lomonte et al.2003). Em nossos resultadosverificamos uma maior atividade miotóxica para os venenos dos jovens (15meses). Por outro lado, a atividade fosfolipásica apresentou um aumento na fasede 24 meses de idade dos animais.
Esta diferença pode ser uma conseqüência da especificidade dos ensaiosutilizados: miotoxicidade (detecção dos níveis séricos da enzima creatina-quinase)e atividade fosfolipásica sobre um substrato sintético (o substrato cromogênicoácido 4-nitro-3 octanoiloxi-benzóico).
A miotoxicidade no envenenamento botrópico tem uma forte correlação comatividade de hidrolases com estrutura “PLA2-like” (tipo-PLA2); enzimas cujo resíduode aspartato na posição 49 é substituído por uma lisina, ou seja, as PLA2 K-49(Gutiérrez e Lomonte, 1989; Gutiérrez e Lomonte, 1995; Kini, 1997; Lomonte etal.2003). Entretanto, a miotoxicidade pode ser resultado da interação de outrastoxinas do veneno com células do tecido muscular. Segundo Gutiérrez e Lomonte(1989), esta atividade pode também ser atribuída indiretamente à atividade decomponentes hemorrágicos dos venenos, como proteases, resultando em umprocesso de isquemia, em que o suprimento de sangue ao tecido muscular estariacomprometido em função de alterações vasculares, como ruptura do endotélio,necrose arterial ou trombose. Moreira et al. (1994), evidenciaram alteraçõeshistológicas em vasos capilares do músculo esquelético (gastrocnêmio) decamundongos injetados com uma metaloprotease hemorrágica isolada do venenode Bothrops asper (BaH1). Sendo assim, a análise dos níveis séricos da enzimacreatina-quinase não representa uma evidência direta da ação de fosfolipases A2.Outro fator que deve ser considerado é a especificidade do ensaio queutilizamos para detectar a atividade fosfolipásica nos venenos, que consiste naatividade hidrolítica de um substrato cromogênico (o ácido 4-nitro-3 octanoiloxi-benzóico). Este ensaio é utilizado para detectar a atividade de fosfolipasescataliticamente ativas, como é o caso das PLA2 D-49, por exemplo. Isso poderiaexplicar a não correlação entre os ensaios de atividade fosfolipásica e atividademiotóxica.
Segundo Guitiérrez e Lomonte (1995) a presença de isoformas defosfolipases A2 no veneno de uma espécie, ou até de um mesmo indivíduo, é umacaracterística comumente observada. Junqueira-de-Azevedo (2003) em análisedos transcritos expressos na glândula de B. insularis, identificou uma seqüênciade cDNA correspondente a uma PLA2 D-49 com estrutura similar (87%) a umaPLA2 isolada de B. jararaca (BJ-PLA2) (Serrano et al.1999). Selistre et al. (1990)isolaram uma PLA2 dimérica de 29 kDa do veneno de B. insularis com atividademionecrótica.
Lomonte e Carmona (1992) reportaram uma regulação ontogenética daexpressão de isoformas de miotoxinas no veneno de Bothrops asper, sugerindo apresença de PLA2 K-49 predominantemente nos venenos dos animais adultos.Contudo, uma análise mais refinada destas enzimas no veneno de B.insularis énecessária para se avaliar a presença de isoformas e, até mesmo, de umaexpressão diferenciada de isoformas no veneno.

5.2 Dimorfismo sexual no veneno de B.insularis?
Optamos por analisar separadamente os venenos dos animais (Intersexo 1,Intersexo 2 e Macho) com o intuito de preservar e evidenciar possíveis diferençasindividuais e sexuais na composição do veneno. Recentemente, Menezes et al.(2006) demonstrou diferenças no perfil proteômico e em algumas atividadesbioquímicas de venenos de machos e fêmeas de uma mesma ninhada deBothrops jararaca.
A divergência de dieta entre os sexos tem importantes implicaçõesecológicas, como por exemplo, a ocupação de diferentes nichos alimentares pormachos e fêmeas, ou ainda, pode refletir o dimorfismo sexual verificado emdiversas espécies de serpentes (Camileri e Shine, 1990; Shine, 1994; Pearson etal.2002).
Nogueira et al. (2003) relataram um expressivo dimorfismo sexual detamanho em Bothrops moojeni, refletido também nos tipos de presas consumidaspor machos e fêmeas adultas desta espécie. Alphonse Hoge et al. (1959) foram osprimeiros a relatar o dimorfismo sexual de B. insularis. Nesse estudo, osexemplares intersexos e fêmeas apresentaram um maior tamanho da cabeça e dacauda, bem como maior comprimento total em relação aos exemplares machos.Além destes caracteres, Wüster et al. (2005) reportaram uma diferenciação emrelação à posição do coração em exemplares machos e fêmeas (intersexos efêmeas verdadeiras) de B.insularis: nas fêmeas o coração encontra-se dispostonuma posição mais anterior em relação aos machos. A posição mais anterior docoração em serpentes arborícolas (em relação a serpentes terrícolas) representauma adaptação fisiológica para o suprimento de sangue a órgãos vitais presentesna cabeça do animal (Lillywhite, 1987). Neste contexto e, pelas característicasmorfológicas de machos e fêmeas de B.insularis, é possível sugerir uma maiorpermanência dos machos no solo em relação às fêmeas. Este fato pode ter umaoutra importante implicação: a composição da dieta entre os sexos. Umadivergência de dieta entre os sexos, isto é, a não sobreposição de nichosalimentares, pode evitar interações ecológicas desarmônicas como a competiçãointra-específica por um recurso (neste caso, o alimento). Este fato poderia ser umdos fatores relacionados com a elevada densidade desta serpente na Ilha daQueimada Grande.
Todavia, como forma de reforçar esta hipótese, seria importante umaanálise do conteúdo estomacal de machos e fêmeas (intersexos e fêmeasverdadeiras), o que possibilitaria uma noção dos itens alimentares consumidospelos dois sexos. Neste trabalho, as diferenças em relação a algumas atividadesbioquímicas e biológicas verificadas para o veneno do macho e dos intersexosforneceram indícios do que pode vir a ser verificado se analisado um númeromaior de indivíduos, contudo a baixa amostragem não permite a extrapolação dosdados para a população como um todo.

5.3 Relação Adaptação x Dieta
Darwin (1859) em sua viagem ao arquipélago de Galápagos já notara aimportância das adaptações para a sobrevivência e conseqüente sucessoevolutivo das espécies, como quando relatou em “A origem das espécies” asdiferenças dos bicos dos tentilhões das diversas ilhas do arquipélago,possivelmente uma característica associada ao tipo de alimento consumido pelasdiferentes espécies.
Na população de B. insularis diversas foram as alterações que conferiram aespécie seu sucesso evolutivo: as alterações morfológicas como o coração emposição mais anterior e a cauda semipreênsil, características de serpentesarborícolas; a coloração pardo-amarelada que possibilita uma camuflagem doanimal em meio a vegetação; o tamanho maior da cabeça, característica comumem espécies ornitófagas e o veneno com uma eficácia para os itens alimentaresdisponíveis na Ilha. Entretanto, a extrema toxicidade do veneno de B. insularis emrelação ao de B. jararaca pode ter sido erroneamente atribuída por Afrânio doAmaral em seus prévios estudos, uma vez que o modelo experimental utilizado naépoca era o pombo e a via de inoculação era intravenosa. As aves constituem oprincipal item alimentar de indivíduos adultos de B. insularis, desta forma, oresultado de ensaios apenas com aves não se torna tão significante se realizadoisoladamente. Por outro lado, esses resultados foram de grande importância naavaliação da seletividade deste veneno em relação a sua principal presa.A dieta tem um importante papel na composição dos venenos de serpentes,atuando não como um fator diretamente modificador, mas selecionador dealgumas características (Fry et al.2003a; Fry et al.2003b; Li et al.2005a; Li etal.2005b).
Como produtos biológicos as toxinas presentes nos venenos estão submetidasa sistemas de controle da expressão gênica que sofrem regulação e modificaçõesque podem afetar o produto final deste conjunto de processos, isto é, a(s) toxina(s)expressa(s) (Neurath, 1984). A duplicação e divergência de genes são apontadascomo uma das principais causas das substituições de nucleotídeos, sobretudo desubstituições não-sinônimas, que levam ao aparecimento de isoformas de toxinascomo as isoformas das enzimas fosfolipases A2, por exemplo (Moura-da-Silva etal.1997; Ohno et al.2003; Li et al.2005a). Este processo chamado de evoluçãoacelerada é um dos principais fatores norteadores da diversificação do potencialbiológico e do espectro de ação das toxinas frente a diferentes alvos/presas(Moura-da-Silva et al.1997; Ohno et al.2003; Li et al. 2005a).Segundo Futuyma (2002) “a oportunidade para a seleção [natural] existequando, em média, diferenças em alguma característica fenotípica resultam emdiferenças consistentes em taxas de sobrevivência ou reprodução”. Após oisolamento geográfico da Ilha da Queimada Grande, a população ancestral de B.insularis enfrentou importantes modificações ecológicas, e a adaptação aoambiente insular (e a todas as suas implicações) foi o fator crucial para asobrevivência da espécie. Contudo, é importante salientar que o veneno não setornou “adaptado” em conseqüência das “novas condições” enfrentadas peloanimal (uma dieta diferenciada, por exemplo), isto porque a seleção natural, nãotendo um caráter providencial (que não atuaria “dotando” um indivíduo decaracterísticas adaptativas), possivelmente atuou selecionando caracteresimportantes para a espécie, e estes provavelmente surgiram aleatoriamente napopulação.
Nas serpentes venenosas, não apenas modificações nos venenos sãoresponsáveis pela diversidade de formas de subjugação das presas. Estruturasrelacionadas a alimentação são também alvos de intensa pressão seletiva, umavez que respondem pela apreensão e sucesso na subjugação de presas. Aubret etal. (2004), demonstrou a variabilidade de tamanho do maxilar e do crânio degrupos experimentais da serpente Notechis scutatus (Elapidae) submetidos, desdeo nascimento, a alimentação com presas de diferentes tamanhos. Com base nosresultados obtidos neste experimento, os autores propuseram uma explicaçãopara a plasticidade desses caracteres morfológicos verificados em populaçõesinsulares e continentais de Notechis scutatus que, na natureza, alimentam-se depresas de diferentes tamanhos (as continentais de presas de menor tamanho emrelação às insulares, apresentando, portanto, um menor tamanho de mandíbula ecrânio). Contudo, atribuir a atividade da seleção natural a apenas a algunscaracteres é, de certa forma, uma visão simplista deste processo, pois comomencionado anteriormente, o sucesso evolutivo da espécie deve-se a uma sériede fatores, entre eles, a composição do veneno.
A atividade letal do veneno (avaliada nos ensaios de Dose Letal média) variouexpressivamente conforme o modelo experimental analisado. Aves e artrópodes,foram utilizados com intuito de representar presas consumidas por B. insularis nafase jovem e adulta, respectivamente. O veneno de B.jararaca (espéciegeneralista e que não apresenta variação ontogenética de dieta) não apresentouvariabilidade ontogenética na Dose Letal média. Embora não tenhamos verificado,uma nítida variabilidade ontogenética nos experimento de Dose Letal média,nossos resultados, independente da idade analisada, demonstram umaseletividade do veneno para presas locais (artrópodes e aves) em detrimento aanimais que não existem na ilha (roedores, neste estudo representado porcamundongos), mas que são freqüentemente itens alimentares da maioria dasserpentes pertencentes ao gênero Bothrops (Martins et al. 2002). Desta forma, épossível sugerir que a letalidade para presas locais é uma característica presenteno veneno desde as fases iniciais de vida, não sendo, portanto uma característicaexclusiva da fase adulta. A seletividade do veneno de B. insularis para o principaltipo de presa consumida por esta espécie na fase adulta (aves) já tinha sidoanteriormente explorada no trabalho de Afrânio do Amaral na descrição daespécie (Amaral, 1921; Amaral, 1927) e em trabalhos subseqüentes (Campos eMello-Filho 1966; Cogo et al.1993; Cogo et al.1998; Rodrigues-Simioni et al.2004). Contudo, um enfoque ontogenético da variabilidade do veneno deB. insularis e suas correlações com a divergência de dieta observada nestaespécie não são reportados na literatura.
Andrade et al. (1996) apresentaram correlações entre a atividade letal doveneno e o tipo de presa consumida por Bothrops moojeni durante suaontogênese. Neste estudo, os autores demonstraram a especificidade do venenode animais jovens para o principal tipo de presa consumido nesta fase de vida:anfíbios.
Em um trabalho subseqüente, os mesmos autores (Andrade e Abe, 1999)mostraram correlações entre a divergência de dieta durante a ontogênese e aatividade letal dos venenos de duas espécies de hábitos alimentaressignificativamente distintos: Bothrops jararaca (uma espécie generalista, mas quese alimenta preferencialmente de endotérmicos na fase adulta) e B. alternatus(uma espécie extremamente especialista, que tem sua alimentaçãoexclusivamente composta de mamíferos). Uma característica importante nestetrabalho é o fato de que na espécie que não apresenta uma alteraçãoontogenética de dieta (B. alternatus) não foi verificada uma diferença significativados valores de dose letal entre jovens e adultos, fato não evidenciado na espéciegeneralista (B. jararaca) que, por outro lado, apresentou maior letalidade na faseadulta. Da mesma forma, Mackessy et al. ,(2006), utilizando diferentes modelosexperimentais, evidenciou a variabilidade ontogenética no veneno da serpenteBoiga irregularis (Colubridae). Os resultados apresentados nestes trabalhosapontam para especializações dos venenos que conferem uma maior eficácia naalimentação de diferentes presas.
Nossos resultados ilustram a complexidade intra-específica presente emvenenos de serpentes, neste caso, representado pela variabilidade ontogenética epossível dimorfismo sexual no veneno de Bothrops insularis. Os dados aquiapresentados apontam para uma especialização do veneno frente a uma dietaespecializada


6. CONCLUSÕES
1. O desenvolvimento biométrico (massa e comprimento) de B.insularisdurante sua ontogênese apresentou expressivo dimorfismo sexual, quetambém se reflete na quantidade de veneno produzido.
2. Os venenos apresentaram proteínas majoritárias nas faixas de 50, 37, 24 e14 kDa.
3. Proteínas na faixa de 24 kDa parecem ter sua intensidade aumentadadurante a ontogênese dos animais analisados.
4. Metaloproteases têm expressiva concentração nos venenos, estandopresentes principalmente nas faixas de 27 e 45 kDa.
5. Os resultados obtidos sugerem uma regulação da expressão de proteases,dado o aumento desta atividade durante a ontogênese dos animaisanalisados.
6. Os resultados experimentais sugerem que fosfolipases A2, diferente dehialuronidases, não têm expressão pronunciada na fase adulta dos animais(41 meses).
7. Os venenos de exemplares jovens (15 meses) de B. insularis apresentaramuma atividade miotóxica mais intensa em relação aos adultos (41 meses).
8. Os venenos dos animais jovens (15 meses) têm maior eficácia na ativaçãodos fatores X e II da coagulação sanguínea, contribuindo para a acentuadaatividade coagulante em relação aos venenos dos animais adultos.
9. Os resultados de Dose Letal média (DL50) sugerem que os venenos dosanimais adultos tendem a apresentar uma maior atividade letal.10. Aves e artrópodes apresentam uma maior sensibilidade para o veneno de B. insularis.
11. A variabilidade ontogenética no veneno de B.insularis pode estar associadacom a divergência de dieta verificada para esta espécie que, na fase adulta, se alimenta de presas relativamente maiores.

Jararaca Ilhoa filhote

Jararaca Ilhoa filhote

Jararaca Ilhoa adulta

Jararaca Ilhoa adulta